| 사람의 Cytochrome P450의 E. coli 내 과발현과 그 응용동 미 숙 / 연구교수 고려대학교 생명공학원 Tel. 02-3290-4146 Fax. 02-3290-3951 E-mail. msdong@korea.ac.kr Cytochrome P450 (P450, CYP)은 생체 내에서 의약품, 외인성 화학물질 및 독성물질 등의 xenobiotics와 steroid 호르몬 등 endobiotics를 산화, 환원시키는 데 관여하는 가장 중요한 phase I 효소이다 (Fig. 1). 1970년대와 1980년대부터 xenobiotics에 대해 각기 다른 catalytic selectivity를 갖고 있는 P450 isozyme들이 여러 포유동물 조직에서 발견되기 시작하여 현재까지 E. coli부터 사람에 이르기까지 500여종의 P450 isozyme 들이 밝혀졌다. 근래에는 이러한 P450 효소의 촉매작용기전, 유전자 구조, 유전자 발현조절 및 각 대사반응에 있어서 개개 P450의 역할 등에 관하여 주로 실험동물을 이용하여 많이 연구되어 독성물질의 작용기전과 신규의약품의 대사경로 연구 및 체내 약물대사에 관한 이해의 폭을 넓혀왔다. 그러나 실험동물 model의 연구 결과를 인체의 약물동태 및 risk assessement에 그대로 적용하는 데에는 매우 유사한 structural gene에 code되어있는 orthologous P450 효소들의 catalytic specificity나 실험동물의 각 P450 효소가 유도되는 정도도 실험동물 종류에 따라 서로 상이하게 다른 경우가 많았다. 실제적으로 신약개발시 rat이나 mouse를 이용한 실험에서는 매우 뛰어난 효능과 안전성을 갖고 있는 약물들이 개, 원숭이 또는 사람에 적용할 때 독성이 크게 나타나 신약개발을 중단하는 경우가 많이 나타난다. 이러한 경우 대부분이 대사 system 특히 P450에 의한 약물의 대사가 동물의 종마다 다르기 때문에 rat이나 mouse에는 생성되지 않는 독성 대사체가 사람에서 생성되기 때문인 경우가 많다. 그 외에도 실험동물로 가장 많이 사용되고 있는 설치류는 사람에서 나타나지 않는 P450 효소의 sexual bimorphism을 나타내는 문제점 등도 지적되고 있다. 이와 같은 이유로서 인체에 있어서 약물대사를 보다 명확하게 이해하고 예측하기 위하여 human P450 효소에 관한 연구가 절실히 필요하게 되었다. 그러나 사람의 native enzyme들을 이용한 각 P450 isozyme들의 역할을 평가하는 것은 여러 요인에 의하여 제한된다. 즉, 개인의 식습관, 유전적 요인, 환경적인 요인에 따라서 P450 isozyme들의 발현양상이 매우 달라지므로 사람의 간 microsome을 이용하여 약물대사를 관찰한 경우에 한 사람의 간 microsome으로부터 얻은 결과는 전체 사람의 효소 활성도를 대표할 수는 없다. 또한 정제된 사람 효소를 이용하려는 시도들은 정제하기에 충분한 양의 human tissue sample을 얻기가 매우 힘들고, 기술적으로도 각 효소들을 순수하게 정제하는 것, 특히 소량 존재하면서 많이 존재하는 아미노산 서열과 유사성이 매우 큰 isozyme들 (예를 들면, CYP3A4와CYP3A5; CYP2C8, CYP2 C9, CYP2C18 및 CYP2C19)을 각각 순수하게 분리하는 것은 거의 불가능하다. 그리고 정제된 효소의 활성도를 측정하기 위하여 P450 효소 활성에 필요한 여러 component들 즉, P450, NADPH-P450 reductase (NPR), phospholipids, 또는 cytochrome b5 등의 다른 화합물질들을 인위적으로 재구성하여 full activity를 얻는 데 있어서 역시 큰 어려움이 따랐다. 이러한 면에서 특정 P450 cDNA들로부터 효소의 heterologous expression은 한가지 효소만을 발현시킴으로써 매우 유사한 아미노산 서열을 갖는 isoform들까지도 정제 및 특성 연구를 할 수 있는 등 여러 장점을 갖고 있다. Cytochrome 450 cDNA을 발현시키기 위한 Host의 조건 P450은 membrane-based 단백질로 noncovalently bound heme (protoporphyrin IX)을 prothetic group으로 함유하고 있다. 몇몇 스테로이드 호르몬 합성이나 콜레스테롤 대사에 관여하는 P450s는 mitochondria에 존재하는데 이들은 mitochondria inner membrane에 삽입되기 위한 processing이 필요하나 xenobiotics 대사에 관련하는 대부분의 P450은 소포체에 N-말단이 anchor되어 있으며 catalytic domain은 세포질을 향하고 있다. Aromatase (CYP19) 외에도 다른 P450에서 phosphorylation이 된다는 보고는 있으나 이들이 효소 활성의 변화를 나타낸다던가 또는 P450이 glycosylation 된다는 등 postranslational modification에 대한 믿을 만한 증거는 아직 보고된 바 없다. 그러나 membrane의 지질구성이 어떤 P450 isoform에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다. 따라서 P450의 functional activity를 발현하기 위하여는 세포는 적합한 heme의 생합성 능력과 충분한 intracellular membranes가 있어야 한다. P450s는 full activity를 위하여 역시 flavoprotein인 NPR과 종종 cytochrome b5 등의 다른 enzymatic component를 필요로 한다. NPR은 NADPH로부터 2개의 전자를 전달하기 위하여 P450과 직접적으로 interact를 하고, cytochrome b5는 어떤 P450 form과 특정 substrate에 전자전달을 항진시키는 데 필요하다. P450의 catalytic activities를 결정하는 데는 두 가지 방법이 있다. 그 하나는 cell lysate나 P450과 효소활성을 나타내기 위한 다른 component를 함유하는 membrane의 subcellular fraction (예를 들면 microsome 분획)에서 assay하는 방법이다. 두번째는 정제한 P450을 lipid vesicle 내에 NPR 그리고 cytochrome b5와 함께 membranes을 reconstitution 하여 full activity를 얻는 방법이다. 그러나 lipid 조성과 reconstitution 조건은 각각 P450 form에 따라 적합하게 달라져야 한다. 따라서 발현된 P450은 whole cell, cell lysate, subcellular fraction 또는 정제한 후 reconstitution하여 characterization 한다. Cytochrome 450 cDNA의 Heterogenous Expression Systems Catalytically active P450의 heterogenous expression에 흔히 사용되는 system으로 다른 여러 단백질들과 마찬가지로 bacteria, yeast, insect cells와 mammalian cells 등이 있다. Bacterial expression은 system 개발이 빠르고, culture medium이나 culture를 위한 기기들이 mammalian 이나 insect cell system 들에 비하여 저렴하다는 잇점이 있으나 발현을 위하여 N-말단을 변형시켜야 하며, electron을 transfer 할 수 있는 NPR이 없다는 것이 단점으로 알려져 있었으나 최근에는 NPR과 cytochrome b5를 동시에 발현시키는 system이 개발되었다. bacterial system은 spectroscopic 또는 효소의 구조연구를 위하여 많은 양의 효소 분리를 위하여는 가장 이상적이다. Yeast는 mammalian P450을 heterogenous하게 발현시키는 데 가장 먼저 성공한 system으로 yeast system을 이용한 P450 발현은 많은 장점이 bacterial expression과 유사하다. 즉 host organism이 비교적 저렴한 배지에서 빨리 성장하고 발현율과 catalytic activity가 비교적 높다. 그리고 사람의 NPR과 사람의 cytochrome b5와의 stable co-transfection approach가 성공적으로 사용되어 CYP3A4와 사람 NPR과 사람의 cytochrome b5를 동시에 발현한 경우에 testosterone의 turnover가 단지 yeast 자체의 NPR이나 cytochrome b5에서 얻어지는 것보다 효소활성이 약 30배 정도 증가되는 것으로 보고되었다1). Yeast 자체에 존재하는 P450이 microsome 제조 때 혼입될 수 있어 적당한 control 제조가 요구된다. Baculovirus expression은 P450와 NPR 모두 높은 발현율을 나타낸다. virus 개발을 위한 여러 편리한 system이 commercially available하나 cDNA-bearing virus의 개발은 상대적으로 많은 노동과 시간을 필요로 한다. Baculovirus expression은 단위 P450 효소 당 높은 P450 content와 높은 catalytic activity의 가장 좋은 조화를 보인다. 그러나 효소들은 host cell 내에서 일시적으로 생산되기 때문에 정확한 harvest time과 다른 배양조건이 최종 산물의 활성도에 많은 영향을 줄 수 있어 제조과정에 따른 variability를 최소화하기 위하여 발현 과정을 매우 세심하게 조절해야만 한다. Mammalian cell expression은 cDNA-발현 세포의 개발과 효소의 production을 위한 최고 수준의 연구력을 요구한다. V79 cells, Chinese hamster ovary cells, HepG2 cells, NIH 3T3 cells와 human lymphoblast cells 등의 많은 host mammalian cell이 P450 cDNA를 발현시키기 위하여 사용되어 왔다. 어떤 level에서는 대부분의 P450 enzyme들은 host mammalian cell의 성장을 저해하기도 한다. 성장에 대한 이러한 효과는 세포 내에서 얻을 수 있는 upper limit으로 나타나나 이러한 limitation 이내에서는 이 system은 아주 재현성이 있으며, co-enzyme들의 native level로 존재를 나타낼 수 있으며, co-expression이나 reconstitution이 필요없다. Mammalian cell expression은 P450 대사체 형성이 독성학적 종말점 (즉, 세포독성, malignant transformation, 또는 mutagenesis investigations)과 couple을 이뤄 나타날 수 있다. 그러나 몇몇 독성학적 종말점은 역시 bacterial 또는 yeast system에서도 측정될 수 있다. Bacteria에 사람 Cytochrome P450의 발현 어떤 heterogenous expression system을 선택하는 가는 연구목적, 비용, 발현율 및 사용상의 용이성 등의 여러 요인들이 영향을 미치나 그 중에서도 발현율과 비용이 최우선적으로 고려된다. 이러한 면에서 볼 때 bacterial system, 특히 E. coli는 DNA 재조합 기술이 발전되는 동안에 단백질의 heterologous expression에 그들의 유용성이 크게 인식되었다. Bacteria를 이용하는 장점으로는 많은 vector들이 상품화되었으며 constructs도 상대적으로 용이하고 bacteria의 성장과 processing이 단순하고 빠르며, 대량 규모의 응용도 가능하다. 그러나 bacteria는 비공유결합된 prosthetic groups을 제외하고는 일반적으로 post-translational modification을 하지 않는다. 그러므로 만일 효소가 활성을 나타내는 데 phosphorylation과 glycosylation이 결정적인 것이라면 bacteria system은 이러한 단백질의 발현을 위하여는 좋은 선택이 아니다. 그러나 prosthetic group은 일반적으로 folding 문제만 없다면 bacteria내에서 생성되어 발현된 단백질 내로 삽입된다. E. coli는 포유동물의 glutathione S-transferase, NAD (P) H:quinone reductase (DT-diaphorase), microsomal epoxide hydrolase와 N-acetyltransferase 등의 여러 약물대사관련 효소들을 발현시키는 데 어려움 없이 사용되고 있다. 그러나 포유동물의 P450은 발현시키기가 힘든 것으로 알려졌는데 아마도 이는 P450의 hydrophobicity와 prosthetic group인 heme의 삽입을 요구하는 데 기인될 것으로 생각되고 있다. P450의 경우에는 전형적인 vector내에 원래의 P450 sequences를 그대로 직접 발현시키려는 시도는 대부분 실패했다. 그 후 P450 holoenzyme을 발현시키기 위하여 E. coli에 의하여 translation을 촉진시키기 위하여 N-말단 염기서열을 변경시키는 데 초점을 맞추었다 (Fig. 2). 이러한 N-말단 부분의 변경은 포유동물 P450의 N-terminal hydrophobic sequence가 catalytic cycle내에서 기질과의 결합 또는 accessory protein과 결합하는 등의 직접적인 역할을 하는 것보다는 membrane anchor로서 기능을 한다는 가설에 기초한 것이다. Larson 등2)과 Li와 Chiang3)은 소수성 N-말단부분의 일정부위를 제거함으로서 각각 토끼와 흰쥐의 P450을 발현시키는 데 성공하였다. Barnes 등은 원래의 bovine P450 17A을 여러가지 다른 vector를 사용하여 발현시키려고 하였으나 실패하였으나 expression vector로 pCW를 사용하면서 두 번째 codon을 E. coli 유전자에서 종종 두 번째 위치에서 나타나는 GCT로 대치하여 높은 발현율을 얻었다4). 그들은 역시 5′ 말단에 있는 다른 염기서열들을 수정하여 염기쌍을 형성 (수소결합)하는 free energy와 mRNA가 translation을 저해할 수 있는 이차구조를 형성하는 경향을 감소시켰다. 재조합 P450 17A의 수정된 N-말단 서열은 다른 포유동물의 P450 효소들의 발현을 향상시키는 데 Barnes 등이 사용한 원래의 vector pCW나 pKK233-2 둘 다에서 사용되고 있다. 새로운 expression construct를 고안하는데 있어서 일반적으로 P450 17A 서열 중 최초의 8-9개 아미노산 서열들이 발현시키고자 하는 P450의 유사한 N-말단 부위에 치환되곤 한다. P450을 E. coli에 발현시키기 위하여는 각 isozyme 당 4-11가지 다른 constructs를 상기에 서술한 일반적인 원리를 이용하여 준비한 후 각각의 발현 수준을 비교한다. 이때 보통 대부분의 경우 한 개나 몇몇 construct만이 실제적인 expression 수준을 보여주며 이러한 constructs는 효소의 정제와 characterization을 위하여 P450을 발현시키는 데 사용되었다. 재조합 P450 17A를 위하여 사용된 N-말단의 치환은 몇몇의 경우 (CYP1A2, 3A4 및 3A5)에서는 성공적이었으나, 다른 것들 (CYP2C10, 1A1, 3A7, 2E1와 2D6)에서는 holoenzyme의 수준이 상대적으로 낮게 발현되었다. 그리고 mRNA transcrips와 발현율에서 이차구조형성을 위한 potential간에 명확한 상관관계가 관찰되지는 않았으나 두 번째 위치에 있는 GCT의 치환이나 hydrophobic N-말단의 제거는 지속적으로 발현율을 향상시켰다. P450 발현을 위한 bacteria system의 장점 중에 하나는 이들 유기체가 heterologous hemoprotein expression을 위하여 요구되는 heme을 과량으로 생산할 수 있다는 것이다. Heme의 생합성은 외관상으로는 E. coli에서 외인성 heme sink의 존재에 따라 상향 조정되며, 전형적으로 철을 포함한 trace element들이 종종 culture media에 첨가될 뿐 heme 전구체의 공급이 대부분의 포유동물 P450들의 발현을 위하여 요구되지 않는다. 그러나 heme의 전구체인 δ-aminolevulinic acid의 첨가가 CYP2D6의 발현에는 절대적으로 필요하며 CYP3A4, CYP2C9 등 몇몇 다른 P450의 발현수준을 향상시키기도 한다5). E. coli에 발현된 P450는 일반적으로 bacteria세포 자체를 약물대사나 독성학적인 assay에 사용하는 것 보다는 일반적으로 단백질을 분리하여 구조 결정에 사용되거나 정제한 효소를 reconstitute시켜 효소 활성도를 측정하므로서 characterization을 하였다. 특히 재조합 E. coli P450들은 일반적으로 bacterial membrane에 존재할 때보다 정제된 후에 촉매활성이 훨씬 높으며6), 이것은 아마도 첨가한 NPR이 bacterial membrane 내의 P450과 상호 작용이 부족한 결과일 수도 있다. Native와 recombinant P450사이에 kinetic 비교는 정제된 native enzyme의 이용 가능성, 특히 소량 존재하는 P450 isoayme들 (즉 CYP3A5나 CYP2C9)을 정제한 효소 내에 아미노산이 서열이 매우 유사하고 간 내에 많이 존재하는 isozyme들 (예를 들면 CYP3A4와 다른 CYP2C계통)이 같이 존재하지 않아야 하며, 더군다나 적당한 양의 개개의 자연산출 효소들을 연구에 사용할 수 있어야 하는 것에 의하여 제한된다. 이외에도 효소들의 kinetics 비교들은 자연산출 또는 재조합 단백질을 위한 최적의 reconstitute condition을 결정하는 데 역시 실험상의 여러 어려움에 의하여도 제한된다. 그러나 여러 가지 가능한 비교 실험들에서 재조합 P450 효소들의 촉매활성 (catalytic acitivity)의 효과적인 재구성을 위하여 필요로 하는 조건들 (즉 cytochrome b5의 첨가)은 심지어는 CYP2E1과 CYP3A 단백질의 경우에서도 간으로부터 정제된 단백질에서 발견된 것과 유사하였다6-8). CYP3A4에서는 외견상의 allosteric effect와 같은 형태가 간과 E. coli에서 유래된 단백질에서 모두 보이고 있다. 현재까지 bacteria에서 생산된 재조합 P450은 native 효소와 비교하였을 때 kinetic 특성이나 기질 특이성에서 극적인 차이를 나타내지는 않는다7). 이러한 관찰은 한정된 N-terminal modification이 된 재조합 P450들이 동종의 사람 효소들의 촉매 활성을 연구하기 위한 적당한 모델이라는 믿음을 뒷받침하고 있다. 정제된 재조합 E. coli P450들은 umu 시험법 (bacteria의 SOS 반응에 기초하여 개발된 유전독성 시험법 중의 하나)과 연관되어 유전독성 분석에서 사용되어 왔다9). 그 결과는 개개 발암물질을 활성화하는 데 있어 사람 P450의 selectivity 면에서 간 microsome과 다른 system으로 행한 연구들로부터 예상되었던 것들과 일치하였다. 예를 들면, liver-specific P450 1A2의 활성화 양상이 사람 간 microsome과 비슷하였다. 그리하여 bacteria를 활성화 효소들을 생산하고 활성화되는 화학물질의 활성도를 분석하는 데 이용할 수 있는 유전독성 분석에 system을 이용할 수 있는 가능성을 보여주었다. 또한 많은 procarcinogen을 활성화시키는 데에 potential cross contamination이 없이 특성이 매우 비슷한 isozyme의 역할을 비교할 수도 있을 것이다. Bacteria System에 사람의 Cytochrome P450과 NADPH-P450 Reductase의 발현 상기에 언급한 대부분의 일들은 P450 효소들을 bacteria에서 생산하여 정제한 후 그들의 사용을 언급하였으나 P450 효소의 분리하는 과정과 reconstitution system의 사용은 시간과 돈이 많이 드는 과정으로 생리활성 물질의 screening을 하거나 유전독성 실험을 하는 등의 많은 효소 및 노동력을 필요로 하는 실험에는 적용이 어렵다는 단점이 있다. 따라서 사람의 P450 효소들을 bacteria 내에서 발현시키는 데 관련된 하나의 목표는 약물대사나 독성시험에 bacteria세포를 직접 사용하는 것이다. P450들이 효소활성을 나타내기 위하여는 NADPH-cytochrome P450 reductase가 NADPH로부터 P450에 전자전달을 하기 위하여 필요하지만 bacteria 내에는 이 효소가 존재하지 않는다. Barnes 등4)은 E. coli 내에 발현된 P450 17A에 의하여 어떤 progesterone 17α-hydroxylation 활성도를 whole cell에서 보고하였으며, Jenkins와 Waterman10)은 E. coli flavodoxin과 NADPH-flavodoxin reductase에 의하여 전자가 전달된다고 하였다. 유사한 관찰이 E. coli에 발현된 사람의 P450 1A211)와 P450 3A412)의 촉매활성도가 whole cell에서 보고되었으나 그 활성은 매우 낮았다. Bacteria 세포 내에서 P450들의 촉매작용을 증가시키기 위하여 bacteria 내에 Flavodoxin과 NADPH-flavodoxin reductase의 과량발현이나 심지어 이들 단백질이 과량으로 P450들에 첨가되었을 때에도 그 촉매활성율은 NPR의 존재하에서 측정한 것보다 매우 낮았다11, 12). Bacteria세포 내에서 활성을 갖는 P450의 발현을 위한 방법으로 최근에는 NPR를 동시에 발현시키는 연구가 활발히 진행되었다. P450과 NPR plasmid 각각을 한 세포에 동시에 transfection시켜 발현시키는 방법인 double plasmid expression system은 한 세포 내에 2종 이상의 plasmid가 존재하면 단백질 발현이 잘 안되고, 또 쉽게 plasmid를 잃어버리는 것으로 평판이 나있어 거의 사용되지 않고 있다. 그 후 bacteria P450인 BM3가 자연적으로 P450과 NPR이 fusion된 형태로 존재하며11), 지방산이 가수분해되는 turn over rate가 두가지 분리된 단백질을 함께 혼합한 어떤 system 보다도 월등히 빠른 것으로 보고됨14)에 따라 여러 연구팀에서 P450-rat NPR fusion protein을 만들어 E.coli에서 발현시켰다15, 16). 포유동물의 P450:NPR fusion 단백질 즉 bovine P450 17A, 흰쥐의 P450 4A1, 사람의 P450 1A1, 1A2, 3A4 및 3A5의 stop codon과 N-terminal region이 제거된 rat NPR construct가 fusion된 형태로 E. coli에서 발현되었다. 특히 rat NPR 대신에 사람의 NPR의 soluble portion을 함유하는 유사한 construct를 발현시키고자 시도하였으나 성공하지 못했는 데 이때 단백질은 제대로 합성되었으나 NADPH-cytochrome c reductase의 활성도는 없었다. 이러한 fusion 단백질은 flavin과 heme domain 두가지를 함유하고 있기 때문에 사람들은 전자전달과 전반적인 기질의 가수분해 속도가 각각의 단백질을 함께 넣고 혼합하였을 때 보다 훨씬 빠를 것으로 예상하였다. 그러나 오늘날까지 연구된 P450: rat NPR fusion 단백질은 촉매적으로는 활성은 있으나 이전에 보고된 각 P450들의 정제한 효소와 NPR를 reconstitute system에서 얻은 결과보다 매우 낮았으며17), 따라서 정제한 NPR을 첨가해야 되는 불편함을 나타내어 그 유용성에 많은 연구자들이 회의를 나타내어 현재는 거의 사용되고 있지 않는 방법이다. 또다른 접근법은 현재 가장 많이 이용되는 방법으로 P450과 NPR 두가지 효소를 한 개의 plasmid로부터 동시에 발현시키는 것으로 poly-cistronic system을 이용하거나 한 plasmid 내에 각기 다른 두개의 promotor를 이용하여 각각의 효소를 발현시키는 방법이다. 1997년에 Nature Biotechnology에 Dr. Guengerich team에 의하여 bicistronic operonion을 이용하여 P450과 사람의 NPR을 한 bacteria 세포 내에 동시에 발현시키는 방법이 소개되었다18). 이것은 두개의 tac promotor가 나란히 존재하는 pCW plasmid 내에 먼저 P450 cDNA를 삽입하고 그 뒤에 ribosomal binding site를 넣어 준 뒤 사람의 NPR cDNA를 넣어 두 효소를 한 promotor에 의하여 동시에 발현시키는 방법이다 (Fig. 3). 이들은 사람에서 xenobiotic를 가장 많이 대사시키는 P450 isozyme 들인 CYP1A1, CYP1A2, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1 및 CYP3A4를 사람의 NPR과 동시에 발현시켜 bacteria 세포와 bacteria membrane을 이용하여 P450 효소 활성도를 측정하였다. polycistronic method를 이용한 E. coli 내의 P450과 NPR의 동시발현에서 P450의 발현수준이 높게는 350 nmol/liter culture (CYP1A2)에서 낮게는 35 nmol/liter culture (CYP1A1) 정도가 발현되었으며, bacterial membrane에서의 약물대사 활성도가 정제한 효소를 reconstitution한 system 보다 활성이 훨씬 크다고 보고하였다. 그 후로 CYP1B1, CYP2A6, CYP2B6, CYP3A5, CYP3A7 등의 P450 isozyme들이 이 방법을 이용하여 NPR과 동시에 발현되어 다양한 실험에 사용되고 있다. 현재는 신약개발시 또는 기존약물의 대사 연구에는 필요할 때마다 사람의 P450 isozyme과 사람의 NPR을 동시에 발현시킨 E. coli 세포 자체를 사용하거나 한번에 많은 량을 발현시킨 후 bacterial membrane fraction을 분리하여 -70℃에 보관하여 필요할 때 사용하는 방법이 주로 사용되고 있다. 또한 사람의 P450의 SNP에 의한 약물대사의 genetic polymorphism을 나타내는 사람으로부터 얻은 P450 gene을 이러한 bacterial bicistronic system에 직접 subcloning하여 매우 손쉽게 SNP을 갖은 P450을 characterization하고 있다. 1998년도에는 일본의 Dr. Kamataki team은 사람의 여러 P450 isozyme 들을 pCW vector내에서 한 개의 단백질 당 한 개의 promotor를 삽입하여 P450과 사람의 NPR을 동시에 발현시키는 데 성공하였다19). Dr. Kamataki team이 만든 CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, and CYP3A4 plasmid는 Salmonella typimurium TA1538에 발현시켜 주로 발암물질을 검색하는 system 개발에 역점을 두고 연구하고 있다. 현재 본 실험실에서는 사람의 cytochrome b5를 사람 간으로부터 cloning하여 사람 P450과 NPR를 동시에 발현시키는bicistronic plasmid와 E. coli 내에 동시에 발현시켜 현재 개발된 E. coli expression system 보다 더욱 활성이 큰 system을 개발하였으며 (Fig. 3), 이를 이용하여 Salmonella typimurium TA1538에 발현시켜 주로 발암물질을 검색하는 system 개발, 약물대사 system 개발 및 CYP 효소의 characterization에 역점을 두고 연구하고 있다. 참고 문헌 1. Peyronneau, M.-A., Renaud, J.-P., Truan, G., Urban, P., Pompon, D., and Mansuy, D., (1992) Eur. J. Biochem. 207, 109-116. 2. Larson, J. R., Coon, M. J., and Porter, T. D. (1991) J. Biol. Chem. 266, 7321-7324. 3. Li, Y. C. and Chiang, J. Y. L. (1991) J. Biol. Chem. 266, 19186-19191. 4. Barnes, H. J., Arlotto, M. P., and Waterman, M. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 195-199. 5. Gillam, E. M., Guo, J. Z., Martin, M. V., Jenkins, C. M., and Guengerich, F. P. (1995) Arch. Biochem. 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